Directrices para médicos sobre el uso de RT-PCR y otros ensayos moleculares para el diagnóstico de infección por el virus de la influenza

Antecedentes

Las pruebas para el diagnóstico de la influenza incluyen pruebas moleculares (incluso las pruebas moleculares de detección rápida), pruebas de diagnóstico rápido de la influenza, inmunofluorescencia, cultivo viral y pruebas serológicas. Esta guía se centra en los ensayos moleculares para el diagnóstico de influenza ya que son cada vez más utilizados en centros clínicos (1). La reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) y otros ensayos moleculares permiten identificar la presencia de ARN de influenza viral en muestras del sistema respiratorio. (Ver Tabla 1 a continuación). Algunos ensayos moleculares son capaces de detectar y discriminar entre infecciones por los virus de la influenza A y B; otras pruebas pueden identificar subtipos de virus A específicos de la influenza estacional [A(H1N1)pdm09 o A(H3N2)]. Estas pruebas permiten obtener resultados en aproximadamente 1 a 8 horas según la prueba. Lo sorprendente es que la detección de ARN con carga viral de la influenza por medio de estas pruebas no necesariamente indica la detección de un virus viable o de la replicación viral actual de la influenza. Es importante señalar que no todos los ensayos han sido autorizados por la FDA para realizar diagnósticos. Los ensayos autorizados por la FDA se enumeran en Tabla 1.

¹ En los Estados Unidos hay disponibles dos ensayos moleculares de detección rápida aprobados por la FDA. Las pruebas moleculares rápidas pueden arrojar resultados en alrededor de 20 minutos. Alere i Influenza A&B fue aprobada por la FDA para usar con hisopados nasales (directo) e hisopados NP o nasales en VTM. Fue aprobado por la CLIA para usar con hisopados nasales (directo) solamente. Roche Cobas Influenza A/B fue aprobado por la FDA y la CLIA para usar con hisopados nasofaríngeos solamente.

Uso de pruebas en la toma de decisiones médicas

• No es necesario hacer pruebas a todos los pacientes con signos y síntomas de influenza para tomar decisiones sobre tratamientos antivirales (ver Figura 1, Figura 2). Una vez identificada la actividad de la influenza en la comunidad o en la zona geográfica, se puede realizar un diagnóstico clínico de la influenza para pacientes ambulatorios con signos y síntomas coherentes con sospechas de influenza, especialmente durante periodos de picos máximos de influenza en la comunidad. Las pruebas moleculares rápidas que permiten obtener resultados en aproximadamente 20 minutos, y otras pruebas moleculares que detectan los virus de la influenza en aproximadamente 60 a 80 minutos, ya están disponibles en los hospitales.
  • No es necesario realizar pruebas serológicas a todos los pacientes con diagnóstico presunto de influenza, sin embargo, dichas pruebas son más apropiadas para los pacientes hospitalizados en caso de que el resultado positivo de una prueba se vea modificado en el manejo clínico.
  • Los médicos deben conocer las muestras clínicas aprobadas para el ensayo molecular utilizado (consulte Tabla 1. Ensayos RT-PCR y otros ensayos moleculares aprobados por la FDA para los virus de la influenza [311 KB, 6 páginas] ).
• Si el tratamiento está indicado clínicamente, NO se debe impedir el tratamiento antiviral a los pacientes con diagnóstico presunto de influenza mientras se esperan los resultados de las pruebas durante los periodos de mayor actividad de la influenza en la comunidad cuando la probabilidad de influenza es alta. Encuentre más información acerca del tratamiento antiviral contra la influenza en Medicamentos antivirales, información para profesionales de los cuidados de salud.
  • Since results from molecular assays  may not always be available when initial therapy decisions must be made, antiviral treatment should be started as soon as possible because the greatest clinical benefit is when treatment is initiated as close to illness onset as possible, especially for patients at high risk of serious outcomes.

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Pruebas de influenza en pacientes hospitalizados

• Los pacientes hospitalizados con diagnóstico presunto de influenza y sin signos de enfermedad en las vías respiratorias inferiores deben someterse a la recolección de muestras de las vías respiratorias superiores para realizar pruebas de influenza. Encuentre más información acerca del tratamiento antiviral contra la influenza en Medicamentos antivirales, información para profesionales de los cuidados de salud.
• La recolección de muestras de las vías respiratorias inferiores de pacientes hospitalizados con influenza presunta o neumonía puede considerarse para la prueba de influenza mediante RT-PCR y otros ensayos moleculares si la prueba de la influenza realizada con muestras de las vías respiratorias superiores dio negativo y si un resultado positivo implicaría un cambio en la gestión clínica. En el caso de los pacientes hospitalizados con presunto diagnóstico de influenza o insuficiencia respiratoria en la asistencia respiratoria mecánica se debe recolectar una muestra mediante aspirado endotraqueal para detectar el virus de la influenza mediante RT-PCR si el diagnóstico de influenza no ha sido confirmado por un laboratorio. Los líquidos obtenidos mediante el lavado bronquioalveolar, recolectados para realizar otros diagnósticos, también pueden someterse a la prueba RT-PCR para detectar el virus de la influenza. Actualmente, el ensayo RT-PCR de los CDC está aprobado por la FDA para muestras del tracto respiratorio inferior; esta prueba está disponible únicamente en laboratorios de salud pública calificados (Ver Tabla 1. Ensayos RT-PCR y otros ensayos moleculares aprobados por la FDA para los virus de la influenza [311 KB, 6 páginas] ). Los médicos pueden optar por solicitar otros ensayos aprobados por la FDA el uso fuera de etiquetas en la evaluación de muestras del tracto respiratorio inferior. La realización de estos ensayos para el análisis de dichas muestras no ha sido evaluada por la FDA; sin embargo, en algunas instituciones se puede acceder más fácilmente a estos ensayos.

Uso de muestras en la detección de brotes institucionales de influenza

• Los ensayos moleculares como RT-PCR son particularmente útiles para identificar una infección por virus de la influenza como causa de brotes de problemas respiratorios en las instituciones (por ejemplo, asilos de ancianos, instalaciones de cuidados crónicos y hospitales).
• Los resultados positivos de una o más personas enfermas con diagnóstico presunto de influenza pueden respaldar las decisiones de implementar de inmediato las medidas de prevención y control para brotes de influenza. Los médicos deben ser conscientes de los requisitos establecidos por las autoridades de salud pública sobre la notificación inmediata de cualquier brote de influenza institucional presunto o confirmado, además de cuándo se deben tomar las muestras respiratorias a personas enfermas y enviarse al laboratorio de salud pública para que confirme el diagnóstico de influenza.

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Uso de muestras en la detección de casos de la nueva influenza A

• Los ensayos moleculares, como la técnica RT-PCR, están diseñados para identificar con precisión el ARN viral de la influenza A y B utilizando genes conservados. Algunos ensayos detectarán los virus de la influenza A o B pero no determinarán el subtipo de virus de la influenza A, y por lo tanto, no podrán indicar si la infección se debe a un nuevo virus de la influenza tipo A. Los nuevos virus de la influenza A son distintos antigénica y genéticamente de los virus de la influenza estacional A actualmente en circulación entre los seres humanos y, por lo general, constituyen una zoonosis; es decir, se transmiten de las especies aviar o porcina a las personas.
• Algunos dispositivos aprobados por la FDA no solo pueden detectar los virus de la influenza A y B, sino también los genes de la hemaglutinina de la influenza A, lo que permite determinar algunos o todos los subtipos de virus de la influenza estacional A [es decir, A(H1N1)pdm09 o A(H3N2)]. Estos ensayos no solo identificarán las cepas de los virus de la influenza A en circulación, sino que también podrán identificar los virus detectados como influenza A para los cuales no se pudo identificar ningún subtipo. Estos virus "no clasificables" pueden representar infecciones por el virus de la nueva influenza A.
• Los médicos y bioquímicos que usan ensayos moleculares y son capaces de detectar todos los subtipos de virus A de la influenza estacional en circulación [es decir, A(H1N1)pdm09 o A(H3N2)], e identifican un resultado "no clasificable" (es decir, influenza A sin subtipo detectado), deben comunicarse con el laboratorio de salud pública local o del estado de inmediato para realizar pruebas adicionales y determinar si la infección fue provocada por un nuevo virus de la influenza tipo A.

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Factores que influyen en los resultados de los ensayos moleculares

Muchos factores pueden influir en los resultados de las pruebas de influenza. La carga viral de la influenza en las vías respiratorias superiores suele reducirse de manera considerable pasados los 4 días en pacientes inmunocompetentes sin complicaciones a causa de la influenza, aunque los bebés y niños pequeños pueden tener una carga viral de influenza detectable por periodos más prolongados. Los pacientes con enfermedades de las vías respiratorias inferiores pueden pueden experimentar una replicación prolongada del virus de la influenza en las vías respiratorias inferiores. Los pacientes inmunosuprimidos y las personas que reciben corticoesteroides sistémicos con enfermedad de las vías respiratorias inferiores también pueden tener una replicación viral más prolongada en las vías respiratorias inferiores. Molecular tests can detect influenza viral RNA (positive results) for a longer duration than other influenza tests (e.g., antigen detection - immunofluorescence or rapid influenza diagnostic tests). Aunque la prueba RT-PCR es la prueba más sensible y altamente específica para el diagnóstico de influenza, diferentes razones pueden generar resultados negativos en personas con influenza; por lo tanto, los resultados negativos de una prueba RT-PCR no siempre pueden excluir el diagnóstico de influenza. Si hay grandes sospechas clínicas de que sea influenza, el tratamiento antiviral debe continuar en pacientes con enfermedad grave o con alto riesgo de presentar complicaciones mientras se recogen más muestras respiratorias y se completa la prueba de influenza.
Los factores que pueden influir en los resultados de las pruebas de influenza son:

• Tiempo desde la aparición de la enfermedad hasta la recolección de muestras respiratorias para analizar
  • Lo ideal es que, en las personas sin infección en las vías respiratorias inferiores, las muestras respiratorias se recojan cuanto antes (en el mejor de los casos antes de 4 días desde el comienzo de la enfermedad cuando la diseminación viral de la influenza está en su punto máximo) y se sometan a las pruebas correspondientes lo antes posible. Los ensayos moleculares puede detectar el ARN viral de la influenza en muestras de las vías respiratorias por más tiempo en comparación con otras pruebas de la influenza (por ej., después de las 72 horas a partir del comienzo de la enfermedad).

• Fuente de las muestras de las vías respiratorias analizadas y manejo de muestras
  • Las mejores muestras de las vías respiratorias superiores para detectar el ARN viral de la influenza por RT-PCR y otros ensayos moleculares son los hisopados nasofaríngeos, lavados o aspirados; otras muestras aceptables son las que se obtienen mediante el hisopado nasal o faríngeo. No debe utilizarse un hisopo con mango de madera para recolectar muestras de las vías respiratorias debido a que pueden interferir con la RT-PCR y otras técnicas moleculares. Los médicos deben conocer las muestras clínicas aprobadas para el ensayo molecular utilizado y qué tipo de hisopados son los recomendados para usar con el ensayo tal como lo indican las instrucciones del fabricante incluidas en el ensayo.
  • Los pacientes hospitalizados con enfermedad de las vías respiratorias inferiores pueden tener una replicación prolongada del virus de la influenza en las vías respiratorias inferiores en comparación con las vías respiratorias superiores. En pacientes con enfermedad en las vías respiratorias inferiores, se deben recolectar y examinar muestras de las vías respiratorias inferiores si se sospecha influenza clínicamente y si el examen de las vías respiratorias superiores es negativo. Para los pacientes enfermos críticos con sospecha de influenza, incluso cuando las pruebas por RT-PCR u otros ensayos moleculares sean negativas, se deberá considerar la recolección de muestras respiratorias adicionales de varios sitios, en especial de las vías respiratorias inferiores (aspirado endotraqueal o lavado bronquioalveolar si se indica clínicamente para realizar otros diagnósticos) y se deberá examinar para encontrar virus de influenza por RT-PCR u otros ensayos molecuares. Debe seguirse con el tratamiento antiviral en dichos pacientes con pruebas adicionales de influenza pendientes.
  • Si la prueba se demora o se realiza en una instalación donde el paciente no está hospitalizado, las muestras deben colocarse en un medio de transporte estéril para virus, de acuerdo a las especificaciones de la prueba, y mantenerse refrigeradas hasta que se lleven al laboratorio lo antes posible. Se deben evitar o minimizar la congelación y descongelación para evitar el deterioro de los virus de la influenza si se realizará un cultivo viral.
  • Se deben seguir las instrucciones de fábrica, incluyendo muestras aceptables, manipulación y almacenamiento y procesamiento, para alcanzar un rendimiento óptimo de las pruebas. Las desviaciones de los procedimientos recomendados pueden ocasionar resultados falsos negativos.

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Interpretación de los resultados de las pruebas

La sensibilidad y las especificidades de la prueba RT-PCR y de otras pruebas moleculares que han sido aprobadas por la FDA para uso diagnóstico son altas en comparación con otras pruebas autorizados por la FDA que utilizan métodos diferentes. Sin embargo, incluso con RT-PCR, puede haber resultados falsos negativos debido a recolecciones de muestras indebidas o poco cuidadosas o de una mala manipulación de la muestra luego de la recolección y antes de la prueba. También puede haber un resultado negativo en la prueba de una muestra recolectada cuando el paciente ya no tiene un virus detectable de la influenza. Puede haber resultados falsos positivos, aunque se dan rara vez (por ejemplo, debido a la contaminación del laboratorio u otros factores).

• Resultado negativo
  • Un resultado negativo significa que no hay evidencia de ARN viral de la influenza en la muestra que se examinó. Para los pacientes hospitalizados, en especial para los pacientes con enfermedad en las vías respiratorias inferiores, si no se identifica ninguna otra etiología y todavía se sospecha clínicamente la presencia de influenza, se deben recolectar y examinar más muestras y se debe iniciar o continuar el tratamiento antiviral.

• Resultado positivo
  • Un resultado positivo indica la detección de ARN viral de influenza en el espécimen respiratorio analizado, lo cual confirma la infección por virus de la influenza, pero no necesariamente significa la presencia del virus viable o que el paciente puede contagiar.
  • Un resultado positivo en las pruebas de detección en especímenes de las vías respiratorias superiores en una persona que recibió por vía intranasal la vacuna atenuada en virus vivos (LAIV) contra el virus de la influenza puede indicar la detección del virus contenidos en la vacuna. La LAIV contiene cepas del virus de la influenza que replican el virus en tejidos respiratorios de menor temperatura (por ejemplo, fosas nasales) que la temperatura corporal interna. Debido a que las fosas nasales se infectan con las cepas vivas del virus de la influenza de la vacuna durante la administración de LAIV, las muestras de las fosas nasales extraídas unos días después de la vacunación con LAIV pueden causar resultados positivos de influenza. Puede ser posible detectar cepas de la vacuna LAIV hasta 7 días después de la vacunación y, en casos menos frecuentes, por periodos mayores.
  • La interpretación de los ensayos moleculares de influenza dependerá de la prueba individual que se realice. Por ejemplo, un resultado negativo de un ensayo molecular de influenza que solo detecta el virus de la influenza A y el subtipo A(H1N1)pdm09 no descarta infección por el virus de la influenza B. Los médicos pueden consultar las descripciones detalladas de cada prueba autorizada por la FDA y qué puede o no puede significar el resultado.

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Ventajas y desventajas de los ensayos moleculares

Ventajas:

• Las pruebas moleculares rápidas y algunas pruebas moleculares disponibles comercialmente permiten obtener resultados en un periodo de tiempo razonable como para emplearlos en las decisiones de manejo clínico (aproximadamente de 20 minutos a menos de 1.5 horas)
• Los ensayos moleculares son más sensibles y específicos para detectar los virus de la influenza que otras pruebas de influenza (por ejemplo, pruebas de diagnóstico rápido de la influenza, Inmunofluorescencia y cultivo viral).
• Las probabilidades de un resultado falso positivo o falso negative son bajas y, por consiguiente, la interpretación del resultado se ve menos afectada por el nivel de actividad de la influenza en la comunidad
• Algunos ensayos moleculares, pero no todos, pueden distinguir entre subtipos específicos del virus de la influenza A

Desventajas:

• Los resultados de algunas pruebas RT-PCR y otras pruebas moleculares pueden no estar disponibles dentro de un periodo clínicamente relevante como para informar las decisiones de gestión clínica.
• La RT-PCR y otras pruebas moleculares pueden no estar disponibles en todas las salas de emergencia o entornos ambulatorios. Para los pacientes hospitalizados, estos ensayos no siempre están disponibles en el lugar.
  • Es posible que las muestras respiratorias tengan que enviarse a un laboratorio estatal de salud pública o laboratorio comercial para RT-PCR. Por consiguiente, aunque la prueba puede arrojar resultados en 4-8 horas, el tiempo real para recibir los resultados puede ser mucho mayor.
• La mayoría de los ensayos moleculares autorizados por la FDA no están aprobados para las muestras de las vías respiratorias inferiores
• Por lo general, RT-PCR y otros ensayos moleculares son más costosos que otras pruebas de influenza
• Algunos ensayos moleculares pueden no identificar de manera específica todos los subtipos de virus de influenza A que circulan actualmente. Según la prueba, un resultado negativo de un subtipo de virus de influenza A no descarta la infección con otro subtipo de virus de influenza A.
• Algunos ensayos moleculares de influenza que se utilizan no están autorizados por la FDA y no se ha realizado una evaluación para conocer la precisión de todos los RT-PCR y ensayos moleculares disponibles. Se encuentra disponible una lista de todas las pruebas autorizadas por la FDA en la Tabla 1. Ensayos RT-PCR y otros ensayos moleculares aprobados por la FDA para los virus de la influenza [311 KB, 6 páginas].
• Las pruebas moleculares rápidas pueden tener una menor sensibilidad para detectar los virus de la influenza, en relación con otras pruebas moleculares.

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Ensayos moleculares de detección rápida

Las pruebas moleculares de detección rápida son un nuevo tipo de prueba de diagnóstico molecular de la influenza que se utilizan para detectar ARN viral de la influenza en especímenes de las vías respiratorias superiores. Una plataforma utiliza la amplificación isotérmica de ácido nucleico, tiene una alta sensibilidad y arroja resultados en 15 minutos o menos. Otra plataforma utiliza la prueba RT-PCR, tiene una alta sensibilidad y arroja resultados en alrededor de 20 minutos. La sensibilidad informada de los ensayos moleculares de detección rápida disponibles varía entre el 66 y el 100%. Al igual que con otras pruebas moleculares de diagnóstico, si el tratamiento está indicado clínicamente, NO se debe impedir el tratamiento antiviral a los pacientes con diagnóstico presunto de influenza mientras se esperan los resultados de las pruebas durante los periodos de mayor actividad de la influenza en la comunidad cuando la probabilidad de influenza es alta. Encuentre más información acerca del tratamiento antiviral contra la influenza en Medicamentos antivirales, información para profesionales de los cuidados de salud.

Referencias

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Información adicional

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• Red Mundial para la Vigilancia de la Influenza de la OMS. Manual para el diagnóstico de laboratorio y vigilancia virológica de influenza [2 MB, 153 páginas].

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Cuadro 1. Ensayos RT-PCR y otros ensayos moleculares aprobados por la FDA para los virus de la influenza